精品久久久久久免费影院_亚洲刺激视频_操处女视频_影音先锋在线电影 - 黄色毛片视频

真相來了！為什么核酸檢測 “ 假陰性 ” 比例高？

2021/3/9




PCR
疫情中的PCR

隨著新冠病毒（COVID-19）的全球大流行，截至今天已經造成了1億人的累積確診，死亡人數更是超過了250萬（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）。病毒核酸檢測是診斷新冠肺炎的主要方法，逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）是目前用于臨床核酸檢測最廣泛的方法。雖然RT-qPCR是檢測核酸的金標準，但是其他方法也應用于疫情的防控，其中包括了數字PCR（dPCR，digital PCR）技術，相比于qPCR，數字PCR是一項新興的核酸檢測技術，應用于核酸的絕對定量檢測，具有高靈敏度，高精確度的優點。



數字PCR和RT-qPCR核心都是基于聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction），RT-qPCR又是在PCR技術的基礎上進行了改進，反應物中添加了熒光染料或利用熒光分子標記的探針，通過實時檢測熒光強度計算DNA模板的擴增量，從而實現對于核酸的定量檢測，實現相對定量的檢測。



而數字PCR基于限定稀釋的概念，將反應體系分割成無數小的反應體系（液滴/微室），每個體系中包含PCR反應的各項成分，經過熱循環反應后對液體的熒光值進行檢測，利用泊松分布計算陽性/陰性的反應體系數量，從而達到對靶標的檢測。相對于RT-qCPR數字PCR不需要校準曲線，其線性數字信號的讀出比qPCR指數放大信號更為準確，這一優勢使得dPCR在技術上優于qPCR。




雖然，RT-qPCR由于其技術上的限制以及樣本病毒量的限制，有出現假陰性的概率，已有多篇文獻報道SARS-CoV-2病毒檢測的不穩定性；影響假陰性RT-qPCR結果因素很多，包括了引物或靶位點突變，樣本獲取/處理不當，以及樣本中存在擴增抑制劑；而數字PCR屬于終點法檢測，對于反應過程中的抑制劑具有較高的敏感性和耐受性，已經被用于新冠病毒的檢測，以減少假陰性結果發生的概率；已有研究表明，經過RT-qPCR檢測的陰性樣本經過數字PCR檢測為陽性，表明了在低病毒樣本量的檢測中，數字PCR的優于RT-qPCR，現階段可以作為其補充。


由于數字PCR的絕對定量特性，即使病毒載量很小，也可以檢測出陽性樣本（低至數十拷貝），而目前疫情防控中，常常要做到如冷鏈產品，各種環境中病毒檢測，這類檢測中病毒載量極小，相比之下數字PCR的具有更好的優勢；

此外，由于新冠病毒屬于RNA病毒，具有較高的突變率；而數字PCR相對于RT-qPCR可以更好的檢測樣本的基因突變檢測，商業化的數字PCR系統檢測靈敏度高達0.01％，對于病毒的溯源和研究提供了良好的手段。




PCR
商業數字PCR的發展


1992年，Sykes等人基于限定稀釋的理論首次提出了數字PCR( digital PCR,dPCR )概念；隨后的1999年，Kinzler和Vogelstein首次使用“ digital PCR ”一詞發表論文，他們描述了通過對樣品進行分區來定量ras突變的方法，以便在微孔板中進行一系列PCR；而隨著技術的發展，數字PCR檢測通量進一步擴大；包括了在集成流路芯片上進行數字PCR反應，2006年Fluidigm基于這種芯片技術推出了第一臺商業化數字PCR系統，the BioMark?，該系統基于微芯片設計，具有小的腔室和閥門用于分割樣品和試劑；第一代芯片數字PCR使用陣列芯片，12通道，765分區；2009年，更新了第二代芯片，使用48通道，770分區，提高了吞吐量并降低了使用成本；同樣是2009年，Life Technologies推出了OpenArray? system，該系統采用了帶有超過3000μm大小的板，通過表面張力維持PCR混合物；2013年，推出了高密度納米流控芯片，可攜帶20000數據點，簡化了工作流程，極大降低了成本；2014年，Formulatrix推出了Constellation system 利用96孔板微流控系統，每孔包含496小室，可單獨進行PCR反應。

此外還有一種基于乳狀液珠包裹PCR反應物-液滴數字PCR的方法，液滴dPCR的工作流程包括了生成含有PCR反應物的水-油微滴，精確調節PCR和油脂化學的設備可以產生數千或者百萬納米升或皮升的均勻液滴，能夠通過微流控通道的快速流動和熱循環過程，而不會破裂或聚合。2011年，Bio-Rad公司推出了QX100 Droplets dPCR系統，利用探針法進行檢測；隨后推出的QX200微滴式數字PCR系統利用探針和嵌入式染料進行PCR檢測；兩個系統都可以產生大約20000納米級液滴，與早期PCR芯片相比成本極大降低；同樣是2012年，Rain Dance  Technologies推出了RainDrop? system可以產生百萬皮升級PCR混合液滴。

數字PCR的工作流程非常簡單；在芯片型dPCR系統中，PCR mix，PCR混合物通常在加載設備的幫助下分布在預制的隔板上，裝載的芯片置于循環加熱器上進行PCR反應，熱循環完成后，使用相機成像芯片對每個分區的熒光強度進行分析，將含有目標分子的分區（正分區）和沒有目標分子的分區（負分區）區別開來；基于歸一化的熒光強度信號，應用一個閾值來分配分區的正負。一些基于芯片的系統也會收集實時的數據，因此可以提供Cq值。




而對于液滴數字PCR系統，PCR混合物和油通常被移入濾筒的孔中，然后濾筒被轉移到專門設計的儀器中，在儀器中產生油包水乳狀液。液滴乳劑轉移到96孔板的孔中或管條中的管中，然后放入熱循環器進行PCR擴增；熱循環后，平板或管被轉移到液滴讀數儀器上，液滴被吸入并以類似流式細胞儀的方式快速流過熒光檢測器，用于測量每個液滴中的熒光。根據熒光信號，應用一個閾值將液滴分配到正或負液滴種群中。

數字PCR是一種絕對定量的終點檢測方法，可以提供超靈敏和絕對的核酸定量。這種技術對于低豐度目標、復雜背景下的目標、等位變異(SNPs)和監測目標水平的細微變化特別有用。隨著數字PCR技術的發展其應用范圍得到更廣闊的拓展，包括各種病原體的檢測，食品安全監督，水質檢測，微生物生態學研究；由于數字PCR具有較高的準確度，因此可以檢測出微小核酸分子的數量差異用于臨床研究，包括生物標志物的開發和檢測；癌癥患者基因組擴增窗臺和基因變異的檢測；遺傳篩查；基因組編輯，干細胞中單核苷酸的突變和拷貝數檢測；以及在移植受體這體內檢測移植物來源的DNA和嵌合體；因此領先的研究小組和生命科學工業界開發基于數字PCR技術的測試，將數字PCR技術用于分子診斷。


MicroDrop?是由永諾生物研發并投入生產的國內首款微滴式數字PCR檢測系統，是我國首款擁有完全自主知識產權的微滴式數字PCR儀，可廣泛應用于科研、醫療、出入境檢驗檢疫等領域。







References
參 考 文 獻

  • Heid CA, Stevens J, Livak KJ et al (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res 6 (10):986–994
  • McCrady MH (1915) The numerical interpretation of fermentation-tube results. J Infect Dis 17(1):183 212. https://doi.org/10.2307/ 30083495
  • Sykes P J , Neoh S H , Brisco M J , et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution[J]. Biotechniques, 1992, 13(3):444-449.
  • Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.
  • Morley A A . Digital PCR: A brief history[J]. Biomolecular Detection and Quantification, 2014, 1( 1):1-2.
  • Phenix-Lan Q , Martin S , Eric B . DPCR: A technology review[J]. Sensors, 2018, 18(4):1271-.
  • Fung B , Gopez A , Servellita V , et al. Direct Comparison of SARS-CoV-2 Analytical Limits of Detection across Seven Molecular Assays[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2020, 58(9).
  • Tan C , Fan D , Wang N , et al. Applications of digital PCR in COVID pandemic[J]. View, 2021:20200082.
  • SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge
  • SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge
  • Jian W , Jun L , Xinguo Z , et al. Clinical Characteristics of Imported Cases of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) in Jiangsu Province: A Multicenter Descriptive Study[J]. Clinical Infectious Diseases.
  • Li Y , Yao L , Li J , et al. Stability issues of RT-PCR testing of SARS-CoV-2 for hospitalized patients clinically diagnosed with COVID-19[J]. Journal of Medical Virology, 2020, 92(3).




掃描二維碼

獲取更多精彩

廣州云星

展開